3D打印技術(shù)作為先進(jìn)制造手段，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域掀起革新，尤其為微流控器件的一體化制備提供了核心技術(shù)支撐。對(duì)于罕見腫瘤病理切片的研究，樣本稀缺與多維分析需求的矛盾長(zhǎng)期存在，而高精度3D打印能精準(zhǔn)構(gòu)建復(fù)雜的微通道、反應(yīng)腔等關(guān)鍵微結(jié)構(gòu)，以及快速一次成型自定義的PDMS芯片模具，縮短制樣周期并保證微通道與腔室的高重復(fù)性，為開發(fā)低樣本消耗、高集成度的病理分析設(shè)備奠定了基礎(chǔ)。針對(duì)病理切片與稀有腫瘤樣本的資源稀缺問題，將微流體模塊與高精度3D打印結(jié)合，能顯著降低所需切片數(shù)量并提升多通道和多標(biāo)記的空間分辨率，使得組織切片處理、微量試劑流控與多通道并行檢測(cè)在臨床和研究中更加可及，成為破解臨床診斷與科研瓶頸的重要技術(shù)。
近日，海南大學(xué)的黃振立、史冰團(tuán)隊(duì)在《Science Advances》在線發(fā)表題為“Dual-mode microfluidic immunostaining device for diagnostic biomarkers detection and tumor microenvironment evaluation”的原創(chuàng)性論著，海南大學(xué)的博士研究生張瑜為本文第一作者，海南大學(xué)的史冰講師和黃振立教授為共同通訊作者。該研究開發(fā)了雙模式微流控免疫染色裝置（Dumi），在1~2張組織切片上實(shí)現(xiàn)了免疫組織化學(xué)（IHC）標(biāo)志物診斷流程與腫瘤微環(huán)境（TME）科研分析的一體化，并能構(gòu)建含多個(gè)診斷標(biāo)志物的空間TME圖譜，便于挖掘腫瘤細(xì)胞亞群與其原位微環(huán)境的關(guān)聯(lián)性。該文章為罕見腫瘤的精準(zhǔn)診斷和TME研究提供了臨床可及的高效解決方案。
首先，研究團(tuán)隊(duì)通過摩方精密的面投影微立體光刻（PμSL）3D打印技術(shù)（microArch? S240，精度：10 μm），制造了核心部件——3D打印流體交換歧管和微流控芯片模具，其微通道尺寸變異系數(shù)小于1%，確保了裝置的結(jié)構(gòu)一致性與運(yùn)行穩(wěn)定性。Dumi裝置集成了雙模式染色功能：多通道模式通過16個(gè)平行微通道，可同時(shí)檢測(cè)16種診斷生物標(biāo)志物；全腔室模式則能完成多輪循環(huán)迭代的免疫熒光染色，構(gòu)建TME空間圖譜（圖1）。微流控系統(tǒng)的連續(xù)流動(dòng)設(shè)計(jì)，將傳統(tǒng)1小時(shí)以上的孵育時(shí)間縮短至10分鐘，試劑消耗和切片使用量分別減少90%和94%以上，且可兼容常規(guī)顯微成像平臺(tái)。
圖1. Dumi裝置結(jié)構(gòu)、工作流程及雙染色模式示意圖。
為提升染色準(zhǔn)確性，研究人員以CD20（膜標(biāo)志物）和Ki67（核標(biāo)志物）為對(duì)象，優(yōu)化了流速和孵育時(shí)間（圖2）。結(jié)果顯示，4 μL/min流速、10分鐘孵育時(shí)，抗原-抗體結(jié)合接近飽和（CD20達(dá)92%、Ki67達(dá)84%），且非特異性背景最低。通過抗體濃度梯度實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了在常規(guī)IHC推薦濃度下，Dumi可直接使用現(xiàn)有抗體，無需重新優(yōu)化，兩種抗體的濃度-響應(yīng)曲線形態(tài)相似，證明方法一致性較好。
圖2. Dumi免疫染色參數(shù)優(yōu)化。
接下來以扁桃體組織CD20染色為模型，對(duì)比Dumi全腔室模式與傳統(tǒng)IHC（圖3）。傳統(tǒng)IHC需235分鐘，且存在明顯邊緣效應(yīng)；Dumi僅需34分鐘，且染色強(qiáng)度分布較為均勻。定量分析顯示，Dumi的信號(hào)變異系數(shù)（<9.307%）低于傳統(tǒng)方法（<11.450%），雖信號(hào)強(qiáng)度略低，但背景信號(hào)更低，信號(hào)背景比（SBR）更優(yōu)，證明二者信號(hào)提取能力相當(dāng)，可相互替代。
圖3. 全腔室模式與傳統(tǒng) IHC 的性能對(duì)比。
接下來，研究人員采用扁桃體組織驗(yàn)證雙模式連續(xù)免疫熒光染色策略，通過多通道IF預(yù)篩選生物標(biāo)志物后，經(jīng)光漂白處理再進(jìn)行全腔室六重免疫熒光染色（圖4）。對(duì)三個(gè)重復(fù)樣本的分析顯示，細(xì)胞表型組成高度相似，t-SNE聚類能清晰區(qū)分免疫細(xì)胞譜系。驗(yàn)證了Dumi在復(fù)雜流程中的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可靠性。
圖4. 雙模式連續(xù)染色的重復(fù)性與細(xì)胞分析。
在臨床應(yīng)用中，研究團(tuán)隊(duì)將Dumi用于4例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL），含1例罕見的原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（PCNS-DLBCL）。病理診斷結(jié)果顯示，通過多通道模式快速完成了自動(dòng)化的16種生物標(biāo)志物檢測(cè)，并請(qǐng)病理學(xué)家進(jìn)行診斷，亞型診斷結(jié)果與病理報(bào)告高度一致。
基于PCNS-DLBCL樣本診斷后的剩余單切片，通過全腔室模式構(gòu)建六重TME圖譜，涵蓋腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。PhenoGraph聚類成功識(shí)別出細(xì)胞毒性T細(xì)胞、輔助 T細(xì)胞等群體。空間分析顯示，CD8a?T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞（CD20?）呈空間排斥關(guān)系，Ripley's K分析證實(shí)其在10 μm以上存在持續(xù)聚類，揭示了“免疫排斥型”TME特征，為TME研究提供了可重復(fù)的分析起點(diǎn)。
最后，研究人員在單一組織切片上實(shí)現(xiàn)多通道診斷標(biāo)志物與全腔室TME圖譜的聯(lián)合分析。NND分析顯示，CD20?細(xì)胞與GFAP?細(xì)胞、CD68?細(xì)胞空間距離最近（中位距離8-10 μm）。不同診斷標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞的微環(huán)境存在差異：如MUM1?、Bcl-2?細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞富集，c-Myc?細(xì)胞則呈排斥；Bcl-6?/CD20?、c-Myc?/CD20?細(xì)胞周圍的CD8a? T細(xì)胞比例升高，表明特定腫瘤亞群能主動(dòng)塑造其微環(huán)境生態(tài)位，為個(gè)性化診療提供了直觀的空間證據(jù)。
總結(jié)：Dumi裝置借助摩方精密微納3D打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)核心部件的高精度制備，突破性解決了罕見腫瘤樣本稀缺造成信息獲取不足的技術(shù)痛點(diǎn)。其雙模式設(shè)計(jì)可通過1-2張切片完成16種標(biāo)志物診斷與TME空間分析，不僅大幅降低樣本消耗，節(jié)省了利用樣本進(jìn)行單標(biāo)記預(yù)實(shí)驗(yàn)的篩選流程，還建立了診斷生物標(biāo)志物與原位微環(huán)境的直接關(guān)聯(lián)，為解析腫瘤免疫逃逸機(jī)制提供了全新方法。該設(shè)備兼容現(xiàn)有臨床病理流程，無需復(fù)雜操作培訓(xùn)，為罕見腫瘤的精準(zhǔn)診斷、預(yù)后評(píng)估和個(gè)性化治療提供了實(shí)用工具，未來有望拓展至原位雜交、空間轉(zhuǎn)錄組等更多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用場(chǎng)景。
原文鏈接：https://doi.org/10.1126/sciadv.aea2586
